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MSC無血清培養基
MSC無血清培養基
英文名稱:MSC NutriStem® XF Medium 無血清培養基總訪問:1022
國產/進口:進口半年訪問:514
產地/品牌:以色列/Biological Industries產品類別:血清/培養基
規       格:05-200-1A/B 基礎培養基, 05-201-1U/06營養添加物 最后更新:2019-12-23
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銷售商: 上海逍鵬生物科技有限公司 查看該公司所有產品 >>
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  • 公司簡介

間充質干細胞無血清培養基

MSC NutriStem® XF Medium

產品描述:

  •  EU注冊證號:DE/CA22/419-33 IVD。

  • 同時取得美國FDA DMF注冊號(No:29469) ,多個單位已用于臨床二、三期驗證。

  • 為多種原代/傳代來源的hMSC(骨髓、脂肪組織、臍帶)培養特別開發。

  • 此hMSC培養體系,無血清、無異源動物成分,且能保持hMSC典型特征,在細胞治療和組織工程中具有高品質高穩定性。 

產品說明書:
​一、目的:利用間充質干細胞無血清培養基培養分離臍帶間充質干細胞。

二、材料:新生兒臍帶

三、主要儀器:醫用手術器械,生物安全柜,CO2培養箱,6孔培養板,T25培養瓶

四、試劑:

1 MSC NutriStem® XF Medium

用途 品牌 貨號 名稱 規格 保存條件
MSC培養基 BI 05-200-1A MSC無血清基礎培養基 500m 4℃
BI 05-201-1U MSC無血清添加劑 3ml -20℃
細胞貼壁 BI 05-752-1F MSC貼壁試劑 1 ml 4℃
BI PLTGOLD010R 血小板裂解物 10ml -20℃
已知血小板裂解物含有大量的外泌體,用戶可依照實驗目的選用合適的貼壁試劑。
細胞傳代 BI 03-079-1A 重組胰酶-EDTA 500ml RT
BI 03-048-1C 大豆胰酶抑制劑 20 ml -20℃
BI 02-023-1A DPBS緩沖液 500 ml RT
輔助試劑 BI 05-713-1B D10 凍存液 100 ml 4℃
BI 03-031-1B 青鏈雙抗 100ml -20℃


五、實驗前準備:

5.1完全培養基的準備

5.1.1凍存的MSC NutriStem® XF Supplement在室溫或2-8℃解凍,避免反復凍融。

5.1.2配制:MSC NutriStem® XF Basal Medium(培養基):MSC NutriStem® XF Supplement(添加物):青鏈雙抗=500ml:3ml:5ml,4℃保存,2周內使用。

注1:雙抗非必須,建議原代(P0)時使用。

注2:培養基含L-Glutamine,貯藏時避免長期照光。

5.2包被培養皿

或跳過此步驟,直接加2%血小板裂解物,促進MSC細胞貼壁與生長。

5.2.1使用DPBS溶液(貨號:02-023-1A),將MSC貼壁試劑稀釋100倍(1:100)。

5.2.2參照表3,加入適量的1X MSC貼壁試劑涂層培養皿或板。

表3  涂層過程中貼壁試劑建議使用量

 

培養器皿

表面積cm2/孔或瓶

1X MSC貼壁試劑使用體積

96孔板

0.34

0.05~0.1 ml

24孔板

1.9

0.2~0.4 ml

12孔板

3.9

0.4~0.8 ml

6孔板/ 35 cm培養皿

9.6

1~2 ml

T25瓶/ 60 cm培養皿

25

2.5~5 ml

T75瓶

75

7.5~15 ml

注1:涂層的培養皿需在無菌條件下2℃-8℃儲存,需在一周內使用。(標示紅色為原廠建議使用量,經過實驗測試后可減半使用)

注2:包被期間, 注意包被液不可以干掉!

3:若使用預包被培養瓶(Corning的CellBind系列,或NEST TC處理系列), 步驟5.2的包被可略過。

5.2.3輕輕搖動培養皿,確認貼壁試劑均勻分布在培養皿表面后,用封口膜包裹涂層的培養皿。

5.2.4在2-8℃孵育過夜;或者在CO2培養箱,37℃,至少孵育30分鐘。

5.2.5接種前, 吸除貼壁試劑,再用DPBS輕輕沖洗培養皿,即可接種細胞。

5.3制備1X大豆胰酶抑制劑

5.3.1使用無菌的DPBS,將50X大豆胰酶抑制劑(03-048-1C)稀釋成1X。

六、使用范例:

6.1 UC-MSC原代培養 (組織塊法)

6.1.1無菌條件下取新鮮臍帶,用DPBS漂洗凈血跡

* 一般臍帶取得非無菌環境,可以稍微用75%酒精潤洗。

6.1.2置250px 培養皿中,剪成1~50px臍段,剔除血管,用DPBS洗凈血跡,再剪成1mm3組織塊。(圖 1)

6.1.3用無菌滴管吸取少量細小組織塊均勻散布在 6 孔板 2 個孔中。

6.1.4 37℃,5%CO2培養箱孵育 30min,以使組織塊粘貼在培養皿壁上。

6.1.5 向每孔滴加0.8ml 完全培養基 (注意沿孔壁小心滴加,勿使沖動組織塊)。

6.1.6 37℃,5% CO2 培養箱孵育過夜,次日 (D1) 每孔再補加1ml 完全培養基。

6.1.7 37℃,5% CO繼續培養,5天 (D6) 后半量換液 (此時一般看不到細胞,但最快3天就可看到細胞從組織邊沿爬出)。

6.1.8再過5天后半量換液 (此時一般會有細胞爬出,但最晚可到14天會出現細胞從組織邊沿爬出) (圖2、圖3)。

6.1.9每2天換一次培養液,繼續培養2~4天,待細胞融合度(Confluency)達到約80%后傳代培養(圖4)。

注1:組織塊培養的關鍵是要保障組織塊始終貼壁,換液動作要盡可能輕微,避免沖動組織塊。培養基加量不能太多,以免組織塊漂浮。

6.UC-MSC原代培養 (消化法)

MSC NutriStem® XF Medium也能有效地培養消化法取得的原代細胞,操做方式可依各實驗室的實驗步驟,或參考上海逍鵬MSC ACF Tissue Digestive Mix (貨號:C35010010) 的使用說明。

6.2.1 將臍帶用DPBS漂洗干凈,剪成1-50px,后剔除血管。

* 一般臍帶取得非無菌環境,可以稍微用75%酒精潤洗。

6.2.2將組織剪成3-5mm3后,移入50ml離心管,再加入的分離液。

* 一條長度10公分的臍帶建議加入10ml的分離液;或者組織塊 : 分離液(vol)= 1:1。

** 視情況而定,可自行在分離液中添加1%青鏈雙抗(BI, Cat# 03-031-1B)。

6.2.3把50ml離心管橫放在37度細胞培養箱,過夜反應(16小時)。

* 若總反應體積較大,也可持續旋轉混合。

6.2.4加入和分離液等體積的0.05%EDTA(BI, Cat#03-015-1B)終止反應后,1500 xg離心5分鐘,去除上清。

* 溶液比較濃稠,小心不要影響下層的細胞;建議留下5ml左右的溶液。

** 若是脂肪組織,沒有粘稠的情形,以常規的200-300 xg離心即可。

*** 沒有EDTA, 可使用無鈣鎂DPBS取代;此時建議后面步驟6多重復2-3次,以確實去除酵素。

6.2.5以和分離液等體積的無鈣鎂DPBS重懸細胞后,500 xg離心5分鐘,去除上清。

6.2.6再次以和分離液等體積的無鈣鎂DPBS重懸細胞后,250 xg離心5分鐘,去除上清。

6.2.7用適量的培養基重懸細胞后,即可按常規細胞培養方法接種P0代細胞培養。

* 消化后的原代細胞,建議培養時接種密度提高到10,000/cm2以上;傳代后即可按常規的接種密度培養。

6.3 UC-MSC傳代培養與凍存

6.3.1待細胞融和度達到約80%后進行傳代(細胞不能太密集,否則容易分化),吸棄傳代板孔中的培養基,每孔加適量DPBS輕輕沖洗1次。

6.3.2根據培養皿適量加入重組胰酶-EDTA(貨號:03-079-1A,T25建議使用1ml),在37℃,5% CO2培養箱作用3~5 min(可輕拍培養瓶幫助細胞脫落)。

6.3.3顯微鏡下觀察細胞完全脫落后,使用5-10ml稀釋大豆胰酶抑制劑(SBTI, 貨號:03-048-1,1X),1000rpm離心3~5min。

6.3.4謹慎吸出上清,細胞團塊用適當體積的完全培養基懸浮后,混勻細胞懸液。

6.3.5按照所需的比例進行傳代或按照5000-6000cells/cm2的細胞密度將細胞接種至培養器皿中,放入37℃, 5% CO2培養箱內培養。

6.3.6每2-3天更換一次培養基,待細胞融合度達到80%左右時,參照操作步驟6.3.1~6.3.5做細胞傳代;或者參照操作步驟6.3.1~6.3.3收獲細胞凍存。

6.3.7細胞凍存:將細胞團塊懸浮于適量 (0.5~1×106cells/ml) D10無血清 凍存液(貨號:05-713-1)中,裝入凍存管,2~8℃冰箱放置30min,-80℃冰箱放置 24h,轉入液氮罐凍存。

:本方法僅供參考,用戶可根據自身經驗做合理調整。

附圖:(如下是組織塊法,建議客戶可以嘗試消化法)

 

        

 圖1剔除臍帶3根動靜脈血管            圖2細胞從組織塊邊沿爬出

         

圖3細胞快速增殖                            圖4傳代時機成熟

產品官網鏈接:https://www.bioind.com/worldwide/nutristem-msc-medium/

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