English | 中文版 | 手機版 企業登錄 | 個人登錄 | 郵件訂閱
廠商 儀器 試劑 服務 新聞 文章 視頻 高級搜索
當前位置 > 首頁 > 技術文章 > 連續斷層3D重構中的超薄切片制備
連續斷層3D重構中的超薄切片制備
點擊次數:1834 發布日期:2019-10-25  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

當需要以納米級分辨率觀察樣品超微結構時,科學家通常借助電子顯微鏡(觀察表面結構的掃描電鏡 SEM 和觀察內部結構的透射電鏡 TEM)——它們是當前科研界可使用的最大顯微成像工具。

 

電鏡成像要求對樣品進行通常 20-150 nm的超薄切片,使用超薄切片機切割的切片厚度薄、表面平整、光滑且無人為干擾因素,因此可以滿足電鏡成像對制備樣品的嚴苛要求。如果大量超薄切片具有樣品結構的前后連續性,SEM 成像采集的圖像就可以進行樣品內部結構的 3D 重建,形成可用于分析的完整超微、精細立體圖像,即連續斷層成像技術(Array Tomography, AT)。

 

今天,小編簡要介紹一下 AT 成功的關鍵環節:連續超薄切片樣品制備。
 

超薄切片之重要性
AT 常用于細胞、蛋白質等生物 / 生物大分子結構的納米分辨率、3D 結構觀察和分析,主要步驟為包埋樣品連續(超。┣衅、TEM / SEM 或光學顯微鏡對其進行成像、對獲得的一系列圖像進行重建分析。AT 可以獲得的有效信息包括超微結構的定量、體積分析和細胞 / 蛋白的形態學數據等,相較于共聚焦顯微鏡獲得的圖像,具有更高的水平和空間分辨率(可達 0.2 nm)。

超薄切片主要用于 TEM 成像前的樣品制備,以納米分辨率觀察樣品內部結構信息。無污染且獲取快速的超薄切片的主要優勢在于:

  • 整個切片均可用于電鏡成像,適合大尺寸樣品分析;

  • 單張切片電子透射均一性好,保證結果可靠性;

  • 制備速度快,短時間即可獲得大量切片;

  • 適用樣品范圍廣,生物樣本和工業材料均適用。
     

    超薄切片的基本原理
    對于 TEM 或者 3D 結構重建,樣品高質量連續切片是前提。因此,一臺如 Leica EM UC7 或者 EM ARTOS 3D(20-50 nm)(見圖 1)一樣穩定可靠的超薄切片機是開展實驗的必備工具。

    ▲圖 1. Leica 連續超薄切片機新品 —— EM ARTOS 3D
    樣品被安裝在可上下前后精準移動的電動機械臂上,機械臂垂直上下移動、遇到固定的玻璃刀或鉆石刀時,第一條樣品帶被切下(圖 2),然后刀臺自動向左移動,按照設定的切片厚度完成第二條切割。同理,隨后刀臺再向左移動,完成第三條切割(圖 3)。從刀片上直接取下切片是十分困難的,因為它非常薄且脆弱,徠卡超薄切片機采用溫和水流托舉的方式使條帶不斷分離,能夠保證條帶質量不被破壞同時操作極其簡單(冷凍切片情況可借助顯微操作),然后進行上電鏡前的其它必要處理。

    ▲ 圖 2. EM ARTOS 3D 超薄切片機樣品切割位置基本結構

     

  • ▲ 圖 3. EM ARTOS 3D 制備的連續超薄切片條帶

    連續斷層成像的樣品制備
     

    多數未處理的生物樣品比較柔軟,AT 成像前的樣品制備主要包括下面幾個步驟:

  • 組織固定

  • 樣品水分抽提和包埋

  • 連續切片和切片條帶收集

  • 切片染色以用于成像(如果需要)

  • 最后使用 SEM 或光學顯微鏡(通常熒光成像情況)對結構上具有連續性的切片進行成像,合成圖像以進行 3D 重建和分析。

     

    對于市面上多數超薄切片機,使用者在 AT 成像的樣品制備時,通常會發現這是一項耗時耗力、中間一些操作必須手工完成的工作。EM ARTOS 3D 是 Leica 2019 年新推出的高端 3D 連續超薄切片機,能夠自動化連續切片、顯著縮短樣品制備時間、減少人工操作、切片無褶皺、厚度均一、溫和水流取條帶、提高樣品制備成功率等眾多優點,在向下兼容普通超薄切片需要的同時,特別合適高通量切片和 AT 等前沿研究對樣品制備的嚴苛要求(視頻 1)。

    數據展示

    ▲ 圖 4. AT 技術獲得的鼠淋巴結 3D 結構重建

    來自:Science and Technology (IST) Austria, Klosterneuburg
     

    相關文獻:

    1. Variety of RNAs in Peripheral Blood Cells, Plasma, and Plasma Fractions

    2. High Resolution Array Tomography with Automated Serial Sectioning

    3. 3-Dimensional Imaging of Macroscopic Defects in Aluminum Alloys

索取資料
來源:徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司
聯系電話:021 - 80316175
E-mail:[email protected]

網友評論 已有[0]人評論
用戶名: 密碼: 匿名 快速注冊 忘記密碼
評論只代表網友觀點,不代表本站觀點。 請輸入驗證碼: 8795
Copyright(C) 1998-2020 中國生物器材網 電話:021-64166852;13621656896 E-mail:[email protected]
新疆35选7